植物在其生命周期经常面临不利的环境条件，如干旱，紫外线，极端温度等。

为了在这些具有挑战性的环境中生存和茁壮成长，植物经过多年的进化和适应，已经发展出各种各样的防御机制。

深入了解这些机制将有助于育种者开发优良品种，供生产实践采用以更有效地应对气候变化。

转录因子已被证明通过自我调节和调节下游靶基因表达在植物生长和发育中起关键作用，并通过结合靶基因的启动子参与主要成分来响应不同的胁迫。

bZIP基因是植物中最大的转录因子家族之一，其家族成员已经在植物、动物和许多其他物种中被鉴定出来。

含有大约70个氨基酸的bZIP结构域具有碱性区域和亮氨酸拉链区域。

bZIP转录因子主要分布在核蛋白植物中。

从烟草中分离到基因，构建了-GFP融合蛋白，前体蛋白从内质网膜分离并进入细胞核发挥作用。

bZIP转录因子家族主要识别ACGT的顺式作用元件，例如ABRE、G-box、A-box和C-box作为启动子区域。

随着bZIP基因的克隆和功能的发现，由于其在非生物胁迫下具有重要的调节功能，受到了研究者的广泛关注。

在白桦的研究中，通过过表达后发现转基因株系的耐盐能力提升。

在用不同浓度PEG-6000处理糜子幼苗后，和这4个基因都表达量随处理浓度的变化呈现显著上调或下调，说明了bZIP转录因子参与了糜子干旱胁迫。

在玉米的研究中，随着NaCl处理时间的延长和的表达量显著升高，在低温处理时，的表达量随处理时间的延长显著升高，说明了bZIP转录因子参与玉米盐和低温胁迫。

在小麦的研究中，过表达可提高植株的耐热性，过表达可提高植株的耐盐性。

综上，bZIP转录因子在植物应对非生物胁迫，包括干旱、高盐、低温和高温等方面具有重要作用。

鱼腥草为蕺菜.干燥地上部分，是一种辛辣的，心形叶状的多年生草本植物，具有很高的食用和药用价值。

幼嫩的茎叶是桌上的一种特殊的蔬菜。

鱼腥草地上部、地下部和地上部干花期的新鲜植物作为常见的药用植物，具有清热解毒、祛痰止咳和镇痛等功效，同时鱼腥草还是许多药物的原料，可加工成西药注射剂或称为“中药抗生素”的中成药，在抗菌、抗病毒方面具有良好的作用，是连花清瘟胶囊、抗病毒合剂的重要成分。

鱼腥草由于其较强的环境适应性，广泛分布于我国南方各省区，西北、华北地区及西藏等地区，但由于各地区的生长环境差异较大，各地区的鱼腥草无论是在外观还是营养成分上都会存在着一定的差异，同样也会存在不同的生态适应性。

本研究以2种不同生态类型的鱼腥草作为材料，以转录组数据为基础挖掘鱼腥草bZIP基因家族成员，以期筛选出使鱼腥草6号和7号药材具有不同环境适应性的候选bZIP基因，为后续繁育出具有更强环境适应性的鱼腥草品种奠定基础。

1材料
共选取2种不同生态类型的鱼腥草作为实验材料。

2020年9月在雅安雨城区濆江南岸的老板山脚下收集到6号药材。

2020年9月在四川省温江市惠和村收集到7号药材。

经绵阳师范学院生命科学与技术学院罗明华教授鉴定为三白草科植物蕺菜.，样本材料保存于该校生命科学与技术学院教学农场，在相同的场地条件和水肥管理2年后，采集地上部分储存在 80℃冰箱用于进一步分析。

2方法
2.1转录组测序及差异表达基因分析
转录组测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成，对于转录组测序结果，使用方法对6号和7号2份材料进行差异表达分析，经过差异分析后，需要用-方法修正多重假设检验的假设检验概率，以获得错误发现率。

差异表达基因的筛选条件为|| 1，FDR<0.05。

2.2鱼腥草
bZIP
基因的鉴定
以转录组测序结果预测的蛋白序列为基础进行鱼腥草bZIP基因的鉴定，bZIP结构域序列下载于Pfam数据库，以此来查询序列以比对蛋白，通过.0软件来鉴定鱼腥草bZIP基因并结合转录组使用iTAK软件所预测出来的bZIP基因为候选鱼腥草bZIP基因。

利用NCBI-CDD数据库对所有候选基因的结构域进行验证，最终确定鱼腥草bZIP基因家族成员。

2.3鱼腥草
bZIP
基因的生物信息学分析
利用所鉴定的基因和已知拟南芥bZIP基因进行系统树。

拟南芥数据下载于TAIR数据库，利用MEGA软件的-方法构建系统进化树。

鱼腥草bZIP基因的理化性质和二级结构利用和在线数据库进行分析。

家族成员的保守结构域利用NCBI进行分析，利用软件的工具分析家族成员的基序，并利用软件进行可视化。

2.4鱼腥草
bZIP
基因的表达分析
根据转录组数据绘制所鉴定得到的鱼腥草bZIP表达量热图和Venn图，并利用软件进行可视化。

将6号和7号2个材料中差异表达的bZIP基因进行K-聚类分析，并利用迈维在线云平台实现可视化。

3结果与分析
3.1鱼腥草
bZIP
基因家族成员进化树分析
将所鉴定得到的163个鱼腥草bZIP基因和拟南芥bZIP进行进化树分析，并根据拟南芥的分类方式进行分类，结果表明，拟南芥bZIP基因共分成11个类别，包括C、S、G、A、I、U、E、H、F、B和D。

鱼腥草bZIP基因被归类到这11个类别中的9个，包括C、S、G、A、I、U、H、F和D，其中被归到D类别中的基因数量最多共有35个，其次为A和I类别，分别有32和31个，被归类到C、S、H和U类别中的基因数量均少于10个，数量最少的为C类别仅有4个，同时可以发现，没有基因被归类到E和B类别中。

3.2鱼腥草
bZIP
基因家族成员的理化性质分析
对所鉴定的163个鱼腥草bZIP基因的理化性质和二级结构进行分析，编码蛋白质的氨基酸数量在~，其中类别A中的32个蛋白的氨基酸数量均在左右，类别S中的7个蛋白的氨基酸数量较少，均在110~。

在这163个蛋白中，相对分子质量在~。

等电点在4.60~9.96，其中有76个蛋白的等电点小于7为酸性蛋白，有87个蛋白的等电点大于7为碱性蛋白。

不稳定系数在28.24~79.99，其中有25个蛋白的不稳定系数小于40为稳定蛋白，有138个蛋白的不稳定系数大于40为不稳定蛋白。

脂肪族氨基酸指数在43.37~105.32。

亲水性系数在 1.284~ 0.065，表明所有的蛋白均为亲水性蛋白。

对二级结构预测后发现，共有161个家族成员由 -螺旋、延伸链、 -折叠和无规则卷曲4部分构成，由 -螺旋、 -折叠和无规则卷曲3部分构成，延伸链的占比为0，由 -螺旋、延伸链和无规则卷曲3部分构成， -折叠的占比为0。

-折叠在所有蛋白中的占比均较低，均低于10%，延伸链在所有蛋白中的占比均低于20%， -螺旋的占比在15.67%~84.17%，无规则卷曲的占比在9.57%~75.00%。

3.3鱼腥草
bZIP
基因家族成员保守结构域及

通过分析基因的保守结构域发现，所鉴定的163个基因均有bZIP家族的保守结构域，进一步证实这些基因均属于bZIP家族成员。

为了分析bZIP家族成员的蛋白特征，对其基序及组成进行分析，共设定了20个基序，其中在163个家族成员中均被鉴定到为最保守的基序，它也构成了bZIP家族成员的保守结构域，由29个氨基酸位点组成。

在类别C和U中的基因其基序结构简单，只鉴定到了。

类别S中的基因基序结构也较为简单，只包含和。

类别A中的基因除了外的其他基因的基序组成均较为丰富，包含了8~9个基序，其中和只在类别A中的基因中鉴定到。

和只在类别I的部分基因中被鉴定到。

和只在类别D和F的部分基因中被鉴定到。

只在类别D的部分基因中被鉴定到。

3.4鱼腥草
bZIP
基因表达分析
根据转录组数据将所鉴定得到的163个基因在6号和7号药材中的表达模式进行分析并绘制了表达量热图和Venn图。

通过表达量热图可以发现，基因在6号和7号鱼腥草的中表现出不同的表达模式，在6号药材中表达的基因共有142个，在7号药材中表达的基因共有158个。

共发现6个基因，包括和在6号和7号药材中均呈现出较高的表达量，其中和在6号药材中的FPKM值均超过100，和在7号药材中的FPKM值超过100，在6号和7号药材中所有的基因中表达量最高的均为。

但大部分的基因的表达量较低，6号药材中有41个基因的FPKM值小于1，7号药材中有23个基因的FPKM值小于1。

同时还发现1个基因在6号和7号药材中均不表达。

通过Venn图可以发现，在6号和7号中均表达的基因共有138个，只在7号药材中表达的基因有20个，其中和的表达量相对较高，FPKM值大于10。

只在6号药材中表达的基因有4个且表达量均较低，其中有3个基因的FPKM值小于1。

3.5不同生态品种中
bZIP
基因差异表达分析
为了进一步比较在不同生态型鱼腥草材料中的表达差异，对6号和7号药材中差异表达bZIP基因进行了分析，共有96个基因在6号和7号2个品种中呈现出差异表达。

通过K-聚类分析后可以发现，这96个基因被分成了2个类别，其中A类别中包括了63个差异基因，这63个基因表现出在7号药材中的表达量与6号相比为上调，其中有多个基因是在6号药材中不表达而与7号药材形成差异且差异倍数较大，在2个材料中均表达而形成较大差异倍数的基因包括和。

B类别中包括了33个差异基因，这33个基因表现出在7号药材中的表达量与6号相比下调，其中是在7号药材中不表达而与6号药材形成的差异，有2个基因包括和在6号和7号药材中均表达，但形成了较大的差异倍数。

4讨论
bZIP转录因子是植物中最大和最多样化的家族之一。

目前，bZIP基因家族已在许多物种中被鉴定，在西瓜和文冠果中分别鉴定得到62和64个bZIP基因家族成员，分析后发现这2个物种中均有14对节段复制事件。

在葡萄的研究中发现，共鉴定到55个bZIP基因家族成员，同样存在14对节段复制事件。

这些也表明节段复制和串联复制均对基因家族成员的扩增具有很大的贡献。

在本研究中，共鉴定得到163个基因家族成员，由于鱼腥草基因组数据测序还未完成，本研究是基于转录组数据进行的家族成员鉴定，因此无法直接判断基因家族成员扩增的具体原因，通过以上前人的结果推测鱼腥草基因同样存在着数量较多的节段和串联复制事件。

鱼腥草在长时间的不断进化过程中需要适应环境变化带来的生存压力，由于bZIP对非生物胁迫具有重要的作用，需要存储环境信息，因此可能也导致了bZIP基因的产生、复制和进化。

为了进一步研究鱼腥草bZIP基因的进化和起源，用拟南芥和鱼腥草bZIP基因进行了系统发生树分析，结果显示163个蛋白分为9个类别，包括C、S、G、A、I、U、H、F和D，每个类别都包含一个或多个基因。

该分类类似于拟南芥，文冠果和柳枝稷。

A类别的大多数功能信息提示在脱落酸或应激信号中的作用。

因此，A类别的在种子和营养组织中似乎都是ABA信号转导的重要参与者。

本研究共有32个bZIP基因被分到类别A中，其中在2个材料中的表达量较高且差异较大，推着该基因可能参与到鱼腥草ABA信号转导途径。

S类别是拟南芥最大的bZIP类别之一，在胁迫处理后也被转录激活或在花的特定部分特异表达。

拟南芥bZIP家族中的S类别的基因在响应低温和干旱有重要作用，本研究中共有7个基因被分到S类别下，其中与6号药材相比在7号中下调表达，和在7号中上调表达，推测这些bZIP基因可能影响6号和7号鱼腥草对低温和干旱的响应差异。

bZIP在植物发育和应对不同生存环境方面起着重要作用。

例如，几个水稻bZIP基因如被鉴定为对冷胁迫反应的调节因子。

西瓜的和可能在保护植物免受线虫感染和低温胁迫方面发挥重要作用。

文冠果中的有多个bZIP基因对盐胁迫和冻害都有反应，而和对脱落酸和低温都有反应。

在马铃薯中和在不同环境中均有高表达且稳定表达。

有研究发现，几个bZIP基因在冷处理后上调或下调表达。

本研究选用了原产地具有不同生态类型的鱼腥草6号和7号药材，6号和7号鱼腥草在表观形态上具有明显的差异，同时通过我们前期测定的相关生理数据发现，它们在多种代谢物含量具有明显差异，包括黄酮类物质，生物碱类物质，挥发性代谢物，这些物质上的差异均导致了这2个药材具有明显的差异。

通过对基因在6号和7号鱼腥草中的表达情况进行分析，所鉴定到的163个基因中有142个在6号药材中表达，有158个在7号药材中表达，同时还发现，只在7号药材中表达的基因有20个，只在6号药材中表达的基因有4个。

为了比较2个品种中表达差异，筛选得到96个差异表达基因，7号与6号相比，有63个基因在7号中表达上调，33个表达下调。