方法
从2026年6至12月在临沂市人民医院生殖医学科接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕夫妇中，收集女方年龄31.5岁，且获卵数在8~20个的不孕夫妇，从中随机挑选30对不孕夫妇收取其第3天细胞胚的培养液共126份，依据其所对应的胚胎的形态级别分为优、中和差3组。

通过液相色谱-质谱联用检测不同培养液中氨基酸和肉碱水平。

通过方差分析比较不同组间氨基酸与肉碱水平的差异，通过相关分析氨基酸与肉碱水平的关联，偏最小二乘法分析氨基酸和肉碱水平与胚胎评估级别的关联。

结果
甲硫氨酸/苯丙氨酸在优胚、中胚和差胚3组间分别为3.09±1.67、4.00±1.19和4.99±2.04，差异有统计学意义，优胚与中胚间、优胚与差胚间及中胚与差胚间差异均有统计学意义。

不同氨基酸之间，苯丙氨酸与酪氨酸的正相关性最强；不同肉碱之间，辛酰肉碱与葵酰肉碱比值与/棕榈酰肉碱比值的正相关性最强；偏最小二乘法拟合模型计算氨基酸/肉碱水平与胚胎级别相关的权重：亮氨酸为2.22，精氨酸为1.99，缬氨酸/苯丙氨酸为1.65，甘氨酸为1.54，酪氨酸为1.21，/辛酰肉碱/C8为1.15。

结论
胚胎培养液中亮氨酸、精氨酸、缬氨酸/苯丙氨酸比值、甘氨酸、酪氨酸以及肉碱比值/C8与体外培养人早期胚胎级别显著相关。

体外受精后第3~5天胚胎处于细胞胚时期，此时是评价早期人类胚胎发育潜力和确定胚胎冻存或移植策略的关键时点。

早期胚胎的发育潜力对体外受精和胚胎移植的成功至关重要。

目前人细胞期胚胎发育潜力主要通过形态评估，但这并不能完全反映胚胎发育潜力，尚缺少客观、灵敏和精确的实验室检测方法和标记物。

代谢组学是通过考察生物体系代谢产物图谱及其动态变化来研究生物体系的代谢网络的一种技术。

研究对象主要是相对分子质量1000以下的内源性代谢物小分子，这些小分子代谢产物的水平变化可将基因表达和蛋白功能的微小变化放大。

有研究表明，胚胎培养液中的氨基酸对胚胎发育至关重要。

氨基酸为胚胎发育提供能量和营养，并维持胚胎渗透压和氧化还原平衡。

缬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在发育潜力高的胚胎的培养基中被消耗，而在发育潜力差的胚胎培养液中不被消耗。

胚胎培养液中缬氨酸水平与临床妊娠有关，另有研究发现天冬氨酸与受孕率呈正相关，甘氨酸和亮氨酸与受孕率呈负相关。

丙酮酸/苯丙氨酸在第3天培养基中的比值也可用于评价胚胎移植潜能，两者的组合预测胚胎移植潜能的值为85.7%。

因此，胚胎培养液中氨基酸水平可以在一定程度上反映胚胎的发育潜能。

肉碱是一种水溶性小分子，可将脂肪酸通过线粒体膜进行 氧化并产生ATP。

肉碱通过参与膜磷脂的乙酰化作用维持膜稳定性而参与改善线粒体功能。

肉碱可防止自由基引起的DNA损伤，还维持乙酰CoA与CoA浓度比值在较低水平，并作为碳水化合物和脂质代谢途径中乙酰单位的储存池。

然而，肉碱对早期人类胚胎发育的影响尚未引起足够的关注。

本研究通过液相色谱-质谱联用检测体外培养不同级别早期人胚胎培养液中代谢物水平，并分析胚胎培养液中氨基酸与肉碱的水平与胚胎发育潜能的关联，从而探讨基于质谱的微量分析技术用于评价胚胎体外发育潜能的可行性。

经临沂市人民医院医学伦理委员会批准，且所有患者均签署知情同意书。

二、主要试剂和仪器人早期细胞胚培养液G1-plus；新生儿代谢性疾病筛查试剂盒；液相色谱-质谱联用检测系统，低氧培养箱。

三、人细胞期胚胎级别评估体外受精后第3天经验丰富的胚胎学家评估早期人类胚胎级别。

Ⅰ级：胚胎发育速度正常，细胞大小均匀，数量相等，细胞质清晰，无空泡，碎片<5%；等级Ⅱ：胚胎发育速度正常，细胞大小大致均匀，数量相等或大致相等，细胞质均匀，无空泡，碎片占5%~10%；Ⅲ级：胚胎发育率大致正常，细胞大小均匀或不均匀，数量相等或不均匀，细胞质中有少量液泡，碎片小于15%；等级Ⅳ：胚胎发育速度异常，细胞大小不均匀，数量不均匀，细胞质不均匀，液泡大量，碎片占10%~50%。

在本研究中，Ⅰ级胚胎被指定为优胚，Ⅱ~Ⅲ级胚胎被指定为中胚，Ⅳ级胚发育潜能极低被指定为差胚。

图1
不同质量胚的形态特征
四、氨基酸和肉碱水平检测卵母细胞受精后转移到50 lG1培养液滴中，每个液滴中一个胚胎，期间不更换培养液。

待受精后第3天更换培养液，取其中30 l转移到直径为1cm的滤纸片上，室温下2h晾干后存于-20℃冰箱待检。

用新生儿代谢性疾病筛查试剂盒检测滤纸片中氨基酸和肉碱水平。

用打孔器从滤纸片中取直径3mm的圆形滤纸片，放入96孔板中。

每孔加入90 l提取液，30℃水平震荡台上孵育。

离心取上清，用液相色谱-质谱联用检测18种氨基酸和44种酰基肉碱的水平。

同时对新鲜培养基和质量控制样品进行分析。

五、统计学分析利用.0进行主成分分析和-DA分析人早期胚胎发育的关键代谢成分。

计量资料用均数加减标准差表示集中趋势，计数资料采用中位数表示集中趋势；用单因素方差分析比较受精后第3天的优胚、中胚、差胚培养液和新鲜培养液中氨基酸和肉碱水平的差异，再采用最小显著性差异检验进行两两比较。

通过相关检验分析氨基酸与肉碱之间的相关性。

P<0.05为差异具有统计学意义。

结果
一、胚胎级别评估，培养液中氨基酸和肉碱水平比较
早期不同级别的人细胞胚形态如图1所示。

优胚细胞碎片最少，中胚其次，差胚细胞碎片最多。

在检测的18种氨基酸中，浓度大于0.5 g/L的氨基酸有11种，其中8种氨基酸包括甘氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸+异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、脯氨酸在不同级别胚胎培养液中的水平差异有统计学意义，且在胚胎培养液中的浓度明显高于未使用的新培养液中浓度。

此外，反映同型半胱氨酸代谢的比值型指标甲硫氨酸/苯丙氨酸、反映氨代谢的比值型指标精氨酸/鸟氨酸，以及反映糖代谢的比值型指标缬氨酸/苯丙氨酸，在优胚、中胚及差胚间或两两比较时差异有统计学意义。

在检测的44种酰基肉碱中，在培养液中的浓度高于0.1 g/L的有14种。

新鲜培养液，优胚、中胚和差胚培养液四组间C8/C2、C8/C10、/C8、/C16水平差异有统计学意义。

C8/C2、C8/C10、C4OH+C3DC/C10、/C16水平在优胚与差胚组间差异有统计学意义。

大部分肉碱水平或不同肉碱组合值在胚胎培养液中的浓度高于未使用的新培养液中浓度。

二、氨基酸与肉碱的相关性分析为进一步探讨培育优质胚胎可能的关键营养成分，我们对氨基酸与肉碱水平之间的相关性进行了分析。

不同氨基酸与肉碱之间多呈负相关，且相关性高于不同肉碱间的相关性。

不同氨基酸之间，苯丙氨酸与酪氨酸的正相关性最强，其次是苯丙氨酸与亮氨酸的相关性；而不同肉碱之间，辛酰肉碱/葵酰肉碱比值与戊二酰肉碱+3-羟基己酰肉碱/棕榈酰肉碱的正相关性最强；氨基酸与肉碱间呈负相关且相关性最强的是蛋氨酸和戊二酰肉碱+3-羟基己酰肉碱/棕榈酰肉碱，其次是蛋氨酸和辛酰肉碱/葵酰肉碱比值，鸟氨酸和戊二酰肉碱+3-羟基己酰肉碱/辛酰肉碱。

三、培养液中胚胎发育关键成分分析采用正交偏最小二乘判别法分析与胚胎发育潜力密切相关的代谢成分。

数据导入.0软件首先进行主成分分析评价结果可靠性和样本总体分布情况，再通过偏最小二乘法拟合模型计算变量权重值，过模型给出的VIP值>1筛选对胚胎发育潜能贡献较大的代谢产物成分，包括以下8种：亮氨酸，精氨酸，缬氨酸/苯丙氨酸，甘氨酸，酪氨酸，戊二酰肉碱与三羟基己酰肉碱/辛酰肉碱的和，苯丙氨酸。

如图2所示，差胚培养液中C5OH+含量较高，优胚和中胚培养液中亮氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量较高。

此图首先直观呈现不同样本间聚集和离散情况，接近图中心的变量对Y的贡献越小；其次，用变量来解释样本间差异，位于观察值附近的变量在观察值中的水平较高，而位于观察值较远位置的变量水平较低。

图2
不同级别胚胎培养液中代谢产物聚类分析图
体外受精和胚胎移植治疗不孕不育的过程中，需建立可靠的方法来选择具有较高发育潜力的单个胚胎移植入子宫。

基于质谱建立的非靶向代谢产物检测技术具有快速、准确、高通量以及样本量少等优点，本研究用液相色谱-质谱联用分析不同级别人早期胚胎培养液中代谢产物水平，为探讨灵敏、客观的胚胎发育潜能标记物提供依据。

由于商品化胚胎培养液中氨基酸的浓度和比例未知，本研究同时分析了新鲜培养液和用过的培养液中氨基酸和肉碱的水平。

以往研究表明，具有较高发育潜力的早期人胚胎培养液中丙氨酸浓度较高，但不能确定其丙氨酸浓度增加的原因是由胚胎合成分泌增加或胚胎对培养液中丙氨酸吸收减少所致。

近来研究表明，人胚胎培养液中较低浓度的Gly和Leu与较高的胚胎发育潜力相关。

等发现，与不能发育成囊胚的胚胎培养液相比，受精后第3天的胚胎能发育成囊胚的胚胎培养液中Ile浓度较低，而Glu、Ala浓度较高。

胚胎发育潜力部分取决于线粒体的功能，因为线粒体驱动氨基酸不仅提供能量，还提供组蛋白和基因组修饰的物质。

研究表明，联合补充3种抗氧化剂可以提高小鼠胚胎质量，降低细胞内过氧化氢水平。

本研究发现，空白新鲜培养液中C5DC+C6OH/C8和C5DC+C6OH/C16的水平高于使用过的培养液，这表明培养液中的肉碱可能被胚胎消耗，而且C5DC+C6OH/C8在优胚培养液中比中胚和差胚的培养液中水平低，而C5DC+C6OH/C8数值增高反映细胞中戊二酸代谢途径异常。

这与以往研究报道结果一致，即酰基肉碱不仅是线粒体内氧化还原过程的底物，还可以以酰基辅酶a的形式产生能量。

虽然目前还不清楚哪种肉碱是人类早期胚胎发育的关键，而我们的研究结果可能会为探讨这个问题提供新的线索。

本研究主要检测了优胚、中胚、差胚3组共126个受精后第3天的人卵裂期胚胎培养液中氨基酸和肉碱水平。

但仍存在以下不足之处：在以后的研究中需进一步优化检测方法，检测除氨基酸和肉碱外的其他代谢产物；还需进一步扩大样本量，尽可能追踪所检测培养液对应的胚胎的体外受精和胚胎移植结局。

参考文献